Antibodies Monoclonal

Antibody Anticorpo
Anticorpo Monoclonale
Monoclonal Antibodies

La tecnologia degli anticorpi monoclonali si è sviluppata negli anni ’70, quando Kohler e Milstein riuscirono a fondere cellule mielomatose immortali con linfociti B produttrici di anticorpi. Una parte degli ibridi ottenuti risultava essere stabile, con caratteristiche tumorali (perdita inibizione da contatto) e capace di produrre anticorpi.
Queste cellule, dette ibridomi, rappresentavano dunque una inesauribile fonte di anticorpi monospecifici (monoclonali).

Parte 1
Come avviene la produzione degli anticorpi monoclonali?

1057796_485790118181568_100375591_n

Il primo passo della produzione di una linea cellulare ibrida che produca un unico anticorpo è l’inoculazione, nel topo (o nel ratto), dell’antigene contro il quale si desidera venga prodotto l’anticorpo.
Dopo parecchie inoculazioni in ed un periodo di alcune settimane, si saggiano gli animali per stabilire se hanno o meno sviluppato la risposta immunitaria.
In caso affermativo essi vengono sacrificati e se ne asporta la milza (organo che ospita i linfociti B, le cellule che producono gli anticorpi), viene lavata e ridotta in poltiglia, si agita poi dolcemente, per liberare le singole cellule, alcune delle quali saranno le cellule B produttrici di anticorpi.
Si mescola la sospensione di cellule spleniche con una sospensione di cellule di cellule mielomatose geneticamente prive dell’enzima ipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasi (HGPRT -).

La miscela delle sospensioni cellulari viene mescolata con glicole polietilenico al 35% per alcuni minuti e successivamente trasferita a un mezzo di coltura contenente ipoxantina, amminopterina e timidina (mezzo HAT).
Il trattamento con polietilenglicole facilita la fusione tra le cellule, ma anche così gli eventi di fusione sono rari e casuali.
Nella miscela esisteranno alla fine cellule mielomatose, cellule spleniche, cellule di fusione mieloma-milza, cellule di fusione mieloma-mieloma e cellule di fusione milza-milza.

Il mezzo HAT, permette la crescita delle sole cellule di fusione mieloma-milza, perchè nessun’altra è in grado di proliferarvi.
Le cellule spleniche e quelle di fusione milza-milza non sono in grado di crescere in alcun mezzo.

Le cellule mielomatose e quelle di fusione mieloma-mieloma, del tipo HGPRT – non sono in grado di utilizzare l’ipoxantina come precursore per la biosintesi delle purine guanina e adenina, che sono, naturalmente, essenziali alla sintesi degli acidi nucleici, non sono capaci di sintetizzare nel mezzo HAT le purine e, di conseguenza, periscono.

Le cellule di fusione milza-mieloma, sopravvivono nel mezzo HAT perchè le cellule di milza contribuiscono con l’HGPRT funzionale, che può utilizzare l’ipoxantina esogena del mezzo anche quando la produzione di purine affidata alla diidrofolato-riduttasi sia bloccata dall’amminopterina, e perché, inoltre, sono attive le funzioni della divisione cellulare delle cellule mielomatose.
Si fornisce la timidina per superare il blocco della produzione di pirimidine causato dall’inibizione della diidrofolato-riduttasi ad opera dell’amminopterina.

Da 10 a 14 giorni circa dopo il trattamento di fusione nel mezzo HAT, come visto, saranno sopravvissute solamente, crescendovi, le cellule di fusione milza-mieloma.
Tali cellule vengono allora distribuite nei pozzetti delle piastre da microdosaggio e fatte crescere in mezzo di coltura completo senza HAT.

La produzione degli anticorpi monoclonali può essere anche condotta mediante iniezione degli ibridomi nella cavità  peritoneale dei ratti, che servono dunque da camera di fermentazione vivente.

Crescendo, le cellule di ibridoma trapiantate producono anticorpi.
Molti dei primi preparati di anticorpi monoclonali venivano prodotti in questo modo, tra questi OKT-3, il primo anticorpo monoclonale approvato per l’uso terapeutico dalla Food and Drug Administration.
Questo metodo presenta però degli svantaggi quali l’alto costo di produzione e il fatto che il prodotto sia contaminato da significativi livelli di varie proteine murine, oltre ad ottenere anticorpi interamente murini (con effetti collaterali anche pesanti).
Di conseguenza la coltura di cellule animali è diventata il metodo di elezione per la produzione di anticorpi monoclonali ad uso farmaceutico.
La rimozione delle cellule dal mezzo contenente gli anticorpi è portata a termine mediante centrifugazione o filtrazione, e normalmente si fa anche una ultrafiltrazione per concentrare il filtrato, che viene poi sottoposto a diverse purificazioni di tipo cromatografico.
A seconda dell’utilizzo previsto, l’anticorpo può poi essere coniugato a specifiche molecole “segnale” (es. radionuclidi o tossine). Alla fine vengono aggiunti al prodotto degli agenti stabilizzanti come tamponi, glicina o anche albumina. Il prodotto viene poi liofilizzato e venduto confezionato in atmosfera di gas inerte.
Immagine
(C.C.C.)

Lascia una risposta

L'indirizzo email non verrà pubblicato. I campi obbligatori sono contrassegnati *